All’interno del museo sono conservate numerose opere pittoriche.

Un’Annunciazione, tempera su tavola del XVI secolo, di Francesco da Tiferno, forse discepolo di Gentile da Fabriano. La tavola presenta due piani. Nella lunetta della parte superiore l’Eterno Padre contornato da angeli, è rappresentato nell’atto di inviare l’angelo a Maria. Nel grande quadro inferiore l’angelo inginocchiato porta l’annuncio a Maria, tutta tesa all’ascolto. La scena dell’annunciazione si svolge in una grande, sontuosa sala, aperta su un ampio paesaggio. Il recente restauro (1990) ha riportato alla luce le rimaste cromie originarie e ha permesso un più razionale consolidamento del supporto ligneo. Il pittore ha realizzato un'altra Annunciazione per la Chiesa di San Domenico di Città di Castello opera oggi conservata presso la Pinacoteca Comunale.

Due affreschi, realizzati nel 1488 da autore ignoto, raffigurano la Madonna con Bambino e San Biagio staccati da una nicchia rettangolare posta all’interno della Chiesa di San Biagio a Colle: al centro vi era la Madonna e su di una fiancata San Biagio l’affresco di San Sebastiano dell’altra fiancata è stato sottratto. La chiesa situata tra la Valle del Niccone e quella di san Leo Bastia, è stata chiusa al culto sul finire degli anni 1960 quando la frazione si è completamente spopolata. Gli affreschi testimoniano la particolare attenzione per molto tempo riservata ad un piccolo centro per la rilevante funzione politica svolta specialmente nel Medioevo.

Tempera su tavola raffigurante San Florido con il Pastorale ed il Libro in mano. Costituiva lo scomparto laterale sinistro di un polittico o trittico, oggi smembrato, che i canonici facevano dipingere nel 1412 da Giacomo di Ser Michele Castellano. Lo scomparto centrale raffigurante la "Madonna e il Bambino", opera di Giorgio di Andrea di Bartolo, maestro senese, è oggi conservato nella Pinacoteca Comunale. Il lavoro rientrava probabilmente nel programma di abbellimento del Duomo Inferiore di Città di Castello fatto dopo il ritrovamento dei corpi dei Santi Patroni Florido e Amanzio nel 1356.

Altro dipinto è quello raffigurante la Madonna in trono con il Bambino e Santi entro una cornice rinascimentale. Ai lati San Giovanni Battista, San Girolamo (vestito dell’abito rosso cardinalizio e con ai piedi la testa del leone) e in ginocchio il Beato Colombini da Siena, fondatore nel 1365 del convento dei Gesuati a Città di Castello. Sulla Predella, suddivisa in tre riquadri, sono raffigurati da sinistra: San Girolamo che toglie la spina al leone, una Natività e San Gerolamo penitente dinanzi al crocifisso. La tempera su tavola è datata 1492 e firmata da Giovanni Battista da Città di Castello. Il dipinto è proprietà del Seminario vescovile, al quale passo la Chiesa di San Gerolamo nel 1653, quando fu soppresso l’Ordine dei Gesuati. L’opera è stata restaurata negli anni ‘60.

Madonna in trono con Bambino, affresco della prima metà del XV secolo, attribuito al Maestro della Crocifissione Volpi e di provenienza perugina. L’affresco posto all’esterno della casa Cenci a Piccione - Perugia fu staccato e restaurato nel 1945. Il Maestro della Crocifissione Volpi non identificato è predecessore del Bonfigli. E’ attivo a Perugia nella prima metà del XV secolo. Dopo un esordio tardo gotico, in rapporto con Pietro di Nicola da Orvieto, si evolve gradualmente in senso rinascimentale. E’ autore di varie opere tra le quali un affresco raffigurante la Crocifissione, che fa parte della "Collezione Volpi" di Firenze da qui il nome dell’autore.

I quattro bozzetti raffiguranti gli Evangelisti, olio su tela del 1751, sono opera di Ludovico Mazzanti, pittore di nobile famiglia orvietana, di formazione romano-napoletana. A Città di Castello affrescò l’originaria cupola del Duomo crollata nel terremoto del 1789, di questo lavoro restano solo gli Evangelisti che sono raffigurati con i loro simboli, San Matteo con l’angelo, San Marco con il leone, San Luca nell’atto di dipingere Maria e infine San Giovanni con l’aquila. L’artista realizzò dipinti anche per il Monastero delle Murate ed altre decorazioni in abitazioni private della città.

Riposo in Egitto, olio su tela attribuito al pittore romano Tommaso Maria Conca: l’opera realizzata a Città di Castello dopo gli affreschi della cupola del Duomo tifernate eseguiti dal 1795 al 1797con il tema della Misericordia Divina. L’artista fu membro dell’Arcadia ed anche dell’Accademia di San Luca di cui fu presidente (1792-95). Le prime sue opere segnano la fase di ricerca, che gli assegna un posto a sé stante sia rispetto al tardo rococò sia al nascente neoclassicismo. I cicli romani, a Villa Borghese e in Vaticano e gli affreschi del Duomo tifernate ne fanno uno dei più interessanti esponenti del neoclassicismo romano. La tela conservata al Museo e considerata di buona qualità ed è forse un omaggio dell’artista a qualcuno dei canonici.